伟德国际1946源于英国農業資源與環境（本碩博班）專業課程介紹
分子生物學‖實驗
Experiment of molecular biology
課程編号：03610014j
适用專業：農業資源與環境（本碩博班）
總學時數：16
總學分：0.5
課程類型：專業基礎
先修課程：普通化學，有機化學，普通微生物學
大綱主撰人：劉華晶
内容簡介
近年來分子生物學在醫藥衛生、農業、環保、輕工等領域有突飛猛進的發展，分子生物學實驗技術已成為生命科學及相關學科院系教學科研不可缺少的一部分。本課程每個實驗都要求學生動手進行實際操作。要求學生掌握基礎的分子生物學實驗技術，提高學生在分子生物學技術方面的動手能力，為專業課程的學習及參加科研實踐打下基礎。
三、教學内容 ：
實驗一、基因組DNA的分離
一．實驗目的
掌握從菌絲中提取基因組DNA的方法。
采用改良的CTAB法，從菌絲體中提取基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，并在紫外分光光度計下測定其濃度，稀釋标定到30ng/μl，置-20℃冰箱儲存備用。
二．實驗原理
通常采用機械研磨的方法破碎菌絲的組織和細胞，由于細胞勻漿含有多種酶類(尤其是氧化酶類)對DNA的抽提産生不利的影響，在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強還原劑(如巯基乙醇)以降低這些酶類的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并減少研磨過程中各種酶類的作用。 十二烷基肌酸鈉(sarkosyl)．十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，簡稱為CTAB)．十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS)等離子型表面活性劑，能溶解細胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以遊離出來。再加入苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA．RNA)水溶性很強，經離心後即可從抽提液中除去細胞碎片和大部分蛋白質。上清液中加入無水乙醇使DNA沉澱，沉澱DNA溶于TE溶液中，即得植物總DNA溶液。
CTAB法原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一種陽離子去污劑,具有從低離子強度溶液中沉澱核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB與蛋白質和多聚糖形成複合物，隻是不能沉澱核酸。通過有機溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質後加入乙醇沉澱即可使核酸分離出來。
CTAB提取緩沖液的經典配方
Tris-HCl (pH8.0)提供一個緩沖環境，防止核酸被破壞；
EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；
NaCl 提供一個高鹽環境，使DNP充分溶解，在于液相中； CTAB溶解細胞膜，并結合核酸，使核酸便于分離；
β-巯基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除
PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡合物，能與多酚形成一種不溶的絡合物質，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結合，有效去除多糖。
用酚抽提細胞DNA時，有什麼作用？
使蛋白質變性，同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時,由于蛋白與DNA 聯結鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
使用酚的優點：1.有效變性蛋白質；2抑制了DNase的降解作用。缺點：1.能溶解10-15%的水，從而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。
氯仿的作用？
氯仿：克服酚的缺點；加速有機相與液相分層。
最後用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）
用酚-氯仿抽提細胞基因組DNA時，通常要在酚-氯仿中加少許異戊醇，為什麼？
異戊醇：減少蛋白質變性操作過程中産生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡産生。另外，異戊醇有助于分相，使離心後的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩定。
用乙醇沉澱DNA時，為什麼加入單價的陽離子？
用乙醇沉澱DNA時，通常要在溶液中加入單價的陽離子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉澱。
簡言之，無論哪種抽提方法，藥品的作用基本都是一樣的
所需藥品及配置：CTAB、氯仿、異戊醇、苯酚、異丙醇、乙醇、TE
（1）70%乙醇：濃度為95%的乙醇70ml加入25ml無菌去離子水，混勻；
（2）<![endif]>TE緩沖液（pH8.0）：10mmol/L Tris·HCl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0）；
（3）TAE電泳緩沖液：
50×濃貯存液：242gTris堿，57.1ml冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0），加水定容至1L；
1×工作液：0.04mol/L Tris-乙酸，0.001mol/L EDTA；
（4）0.5M EDTA（PH 8.0） 100ml：在80ml水中加入18.01g EDTANa2.2H2O攪拌溶解，用NaOH調PH至8.0（約2gNaOH顆粒），定容至100ml高壓滅菌備用；
（5）5mol/L NaCl：800ml水中加入292.2g NaCl溶解，定容至1L，高壓滅菌後備用；
（6）10%十二烷基硫酸鈉（SDS）：在900ml水中溶解100g SDS，加熱至68℃助溶，加水至1L，分裝備用；
（7）1M Tris-cl（PH 8.0）100 ml:12.11g Tris堿；ddH2O ，80ml；HCl，4.9 ml三者混勻充分溶解後，滴加濃鹽酸調PH至8.0，定容至100ml
8）2×CTAB 提取液（PH 8.0）：2% CTAB，1.4MNacl，0.02MEDTA，0.1MTris-cl。即稱取CTAB 2 g加蒸餾水40ml，加1M Tris-cl（PH8.0）10ml，0.5M EDTA（PH 8.0）4ml和5M NaCl 28ml,待CTAB溶解後用蒸餾水定容到100ml具體配置為：CTAB2克，Nacl 8.182克，1M Tris-cl（PH8.0）10ml，0.5M EDTA（PH 8.0）4ml，稀釋至100ml
（9）PCA：Tris-平衡酚25ml，三氯甲烷24ml，異戊醇1ml，現用現配，不宜長時間存儲；
（10）GoldView：一種可代替溴化乙錠（EB）的新型核酸染料，其靈敏度與EB相當，使用方法與之完全相同：在100ml瓊脂糖膠溶液中加入5ml GoldView即可。在紫外透射光下雙鍊DNA呈現綠色熒光，也可用于染RNA；
(11)3M的NaAC:40毫升去離子水，加40.81克三水合乙酸鈉，冰醋酸調PH至5.2，定容至100毫升，滅菌。
實驗步驟：改進CTAB法基因組DNA提取
（1）<![endif]>将準備好的菌絲放入研缽中，加液氮研磨成粉末後收集到1.5ml離心管中，每管中加入的菌絲粉末量約0.04克左右，注意：1）菌絲體上的水分要盡量少，這樣方便将菌絲充分研磨成粉末；2）每一管中不要裝入太多菌絲粉末，防止裂解不充分影響提取效果；3）粉末加入試管時一定要動作迅速，防止菌絲粉末融化成團降低裂解效果；4）研磨過程中保證菌絲一直處于液氮的液面以下，使菌絲處于冷凍狀态，防止反複凍融造成DNA的降解；
{菌絲準備：将培養好的菌絲用紗布過濾進行收集，用無菌去離子水沖洗菌絲2～3次，洗去菌絲表面多餘培養液等雜質，再用濾紙吸幹菌絲上多餘水分，置于烘箱中50℃烘幹1小時（使菌絲進一步幹燥，保證研磨提取效果），取出後置于－80℃冰箱冷凍保存。}
（2）往離心管中加入事先配制好的CTAB 提取液溶液0.3ml，颠倒震蕩使菌絲與藥品混合充分；
（3）放在水浴鍋中，65℃水浴處理30min，每5min上下颠倒一次（不能劇烈震蕩避免菌絲基因組DNA因震蕩造成物理破壞）；10000rpm/min離心l0min取上清液。
（4）加入和上清液等體積的PCA溶液，颠倒混勻，放入離心機中10000rpm/min離心l0min；
（5）取上清，加入1/2體積的2%的CTAB，再加入和上清等體積的氯仿：異戊醇=24：1，震蕩混勻，輕搖10分鐘，10000rpm/min離心l0min，取上清液。
（6）重複步驟5，直至中間層無白色沉澱為止。
（7）取第6部的上清液，加入1/10體積的3M的NaAC，加入2倍體積的無水乙醇，将離心管置于－20℃，靜置30min；
（7）12000rpm/min離心10min，棄上清，得到沉澱DNA，用70%乙醇浸洗沉澱2次，自然風幹；
（8）待沉澱幹燥，向管中加入适量TE緩沖液溶解沉澱；
（9）在含有0.5μg/ml核酸染料的1％瓊脂糖凝膠上檢測DNA樣品的質量，并在紫外分光光度計下測定其濃度，稀釋标定到50ng/μl，然後分裝，－80℃保存。
第二種提取DNA方法，優點：雜質較少
實驗二DNA純化（按試劑盒操作）
一．<![endif]>實驗目的
将已經提取的DNA進行純化
二．實驗原理
首先利用瓊膠電泳将不同分子量的DNA片段分開,将某一特定分子量區域的瓊膠切下,利用DNA extraction kit将DNA從瓊膠中溶出并濃縮.
實驗材料 ( 6X gel-loading dye:15% Ficoll 400, 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol ( 紫外光箱 ( 下列試劑來自GeneAid公司所售的Gel/PCR Fragment Extraction Kit: * DF Buffer * Wash Buffer * Elution Buffer:10mM Tris-HCl(pH8.5) * DF Column * 2ml Collection Tube
三、實驗步驟
A.将欲分離之DNA混合物以0.7%瓊膠電泳分離.
B.電泳後,将瓊膠置於紫外光箱上觀察,把含有欲純化之DNA片段的瓊膠部位切下.
C.将步驟B的瓊膠以藍色微量吸管盡可能戳碎.
D.加入500ml DF buffer,55oC作用10分鐘,每2-3分鐘搖晃數次,直至瓊膠完全溶解.
E.将步驟D瓊膠溶液全部吸入DF Column,并套上Collection Tube(收集過濾液).
F.8000rpm離心1分鐘,将過濾液倒掉.
G.加入500ml Wash Buffer,8000rpm離心1分鐘,過濾液倒掉.
H.14000rpm離心2分鐘.
I.将DF Column轉移至上另一乾淨的微量離心管.加入15ml Elution Buffer,室溫靜置2分鐘.
J.14000rpm離心2分鐘,微量離心管内之液體即為純化的DNA片段.
K.取0.5ml純化的DNA加入4.5mlDDW及1ml 6x DNA loading dye,跑0.7%瓊膠電泳,與marker比較,估計DNA的濃度.
實驗三 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA
一．實驗目的
1．掌握制不同濃度的瓊脂糖凝膠的方法。
2．學會用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法。
二．實驗原理
DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子的高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結構上的重複性質，相同數量的雙鍊DNA幾乎具有等量的靜電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應，即DNA分子本身的大小和構型。具有不同的相對分子質量的DNA片段泳動速度不一樣，可進行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質量的對數值成反比關系。凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質量的DNA，也可以分離相對分子質量相同，但構型不同的DNA分子，如pUC19質粒，有3種構型：超螺旋的共價閉合環狀質粒DNA（covalently closed circular DNA,簡稱cccDNA），開環質粒DNA，即共價閉合環狀質粒DNA 1條鍊斷裂（open circular DNA ,簡稱ocDNA），線狀質粒DNA，即共價閉合環狀質粒DNA2條鍊發生斷裂（linear DNA, 簡稱L DNA）。這3種構型的質粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移速度不同。因此電泳後呈3條帶，超螺旋質粒DNA泳動最快，其次為線狀DNA，最慢的為開環質粒DNA。
三．儀器與試劑
（一）儀器
1．瓊脂糖凝膠電泳系統
2．凝膠成像系統
3．微波爐
4．移液槍（二套包括1000、10-200、20-100、0.5-10、0.1-2.5微升）
（二）試劑
１．5×TAE（5倍體積的TAE貯存液）
配1000ml 5×TAE：
Tris 242g
冰乙酸 57.1ml
0.5mol/l EDTA 100ml（pH 8.0）
２．凝膠加樣緩沖液（6×）
溴酚藍 0.25%
蔗糖 40%（w/v）
３．瓊脂糖
４．核酸染料（goldview I型核酸染色劑 ）
四．實驗步驟
１．制備瓊脂糖凝膠
按照被分離DNA的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量。可參照下表：
瓊脂糖凝膠濃度/% 線性DNA的有效分離範圍/kb
0.35～60
0.61～20
0.70.8～10
0.90.5～7
1.20.4～6
1.50.2～4
2.00.1～3
稱取0.3g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入30ml 1×TAE緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全溶化，取出搖勻，則為1%瓊脂糖凝膠液，按100ml的凝膠加5μl的EB。
２．膠闆的制備
取有機玻璃内槽，洗淨，晾幹，用橡皮膏将有機玻璃内槽的兩端邊緣封好（一定封嚴，不能留縫隙）。将有機玻璃内槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。将冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機玻璃内槽，直至有機玻璃闆上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）。待膠凝固後，取出梳子，取下橡皮膏，放在電泳槽内。加入電泳緩沖液至電泳槽中。
３．加樣
用移液槍将已加入上樣緩沖液的DNA樣品（可将上一次實驗産物作電泳材料）加入加樣孔中（記錄點樣順序及點樣量）。
４．電泳
接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負極，DNA片段從負極向正極移動）。DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5V/cm。當溴酚藍染料移動到距凝膠前沿1-2cm處，停止電泳。
實驗四 聚合酶鍊反應技術ITR-PCR技術
一．實驗目的
通過本實驗學習PCR反應的基本原理與實驗技術。
二．實驗原理
三．儀器與試劑
（一）儀器
１．PCR熱循環儀
２．PCR管
３．瓊脂糖凝膠電泳系統
４．凝膠成像系統
（二）材料與試劑
1．随機引物（10mer）（5μmol/L）：購買成品。
2．Tag酶
3．10×緩沖液
4．MgCl2：25mmol/L
5．dNTP：每種2.5mmol/L
四．實驗步驟
1、選用通用引物ITS1和ITS4（ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGC-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）擴增5.8S rDNA及其兩側的ITS1和ITS2基因片段。PCR擴增反應在PCR擴增儀上進行。
2、反應體積為50ul，其成分為：模闆1μl，引物ITS 1和ITS 4 (2×10-5mol/L)各5μl（上海生工)， 10×PCR緩沖液(pH8.3) 5μl， dNTP (0.01mol/L) 4μl（TaKaRa）， Taq酶(5U/μL) 0.25μl（TaKaRa），超純水30μl定容至50μl。
ITS-PCR擴增條件： 94℃預變性5 min；94℃1 min，54℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，循環36次， 72℃延伸10min，産物于4℃保存。
3．瓊脂糖凝膠電泳
配制1%瓊脂糖凝膠，取5μL擴增産物電泳。穩壓100-120 V（電壓低帶型整齊，分辨率高）。電泳結束後，紫外燈下觀察結果。
教學大綱說明
一、教學目的、課程性質任務，與其他課程的關系，所需先修課程。
分子生物學是研究核酸等生物大分子的功能、形态結構特征及其重要性和規律性的科學，分子生物學已成為生物技術專業教學計劃中重要的核心課程，因此它是十分重要的一門必修課程，是培養造就生物技術和生命科學高層次專門人才所需基本素質的重要課程。通過本課程的學習，可使學生在分子水平上去分析、理解生命的奧秘，并運用相關理論和原理去分析和解決實際問題，有利于提高學生科學素養、樹立正确的科學觀、培養分析問題解決問題的能力，為生物技術拓展和生命科學的縱深發展奠定堅實的基礎。
二、教學要求及選編教材的依據。
教學活動能力培養要求：通過分子生物學知識的傳授，培養學生從分子水平上去分析、理解生命現象與過程，培養學生思考與探索生命的奧秘的能力。通過分子生物學實驗，培養學生基本的分子生物學實驗技能和基本的科學素養，以及分析和解決實際問題的能力。
三、教學環節和教學方法。
分子生物學注意體現學生為主體、教師為主導的讨論式教學，多采用啟發式、讨論式的教學方法，激發學生的學習積極性。主要使用多媒體，采取講授和讨論相結合方式進行教學。
充分利用現代教育技術多媒體手段進行教學，理論聯系實際，讓學生通過實驗更好的理解書本的知識，取得良好的效果。
四、改革思路和說明。
采取普遍聯系的學習方法，結合先修課程，從遺傳與信息表達的角度更多地思考，并與生物技術大實驗相結合，理論聯系實踐。建議學生參與相關課題研究，關注學科發展前沿和分子生物技術的開發與利用。
